澳门新浦京网投站网止一例副猪嗜血杆菌病的诊治报告

鸡传染性鼻炎是由副嗜血杆菌(Haemophilus
paragallinarum,Hpg)引起鸡的急性呼吸系统疾病。该病主要症状为鼻腔与鼻窦发炎、流鼻涕、脸部肿胀和打喷嚏。可引起蛋鸡产蛋量下降,育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加,肉鸡肉质下降。本病在世界各地均有流行,造成很大的经济损失⋯。在我国,鸡传染性鼻炎的发病率可达20%~50%,死亡率可达5%~20%。近年来,鸡传染性鼻炎在我国各地时有发生,严重危害我国养鸡业的发展,因此,对该病进行快速诊治具有重要意义。1.
发病情况

2014年6月,云南省保山市某养鸡场共饲养海兰褐壳蛋鸡9000只,其中2幢相邻鸡舍的3
200羽产蛋鸡中出现了一种以流鼻涕、打喷嚏、颜面肿胀、呼吸困难为特征的呼吸道疾病,其发病率约25%,死亡率约10%,产蛋率下降约20%,给该鸡场造成巨大的经济损失。为查明病因,对该病进行科学防控,笔者对发病鸡和病死鸡进行病理剖检和实验室诊断。2.
剖检变化

对12只病死鸡进行剖检,可见大部分鸡鼻道内有大量透明或浅黄色黏液,大部分鸡鼻窦内有大量干酪样物质,有的鸡鼻窦内有大量浅黄色脓性黏液,气管内也有大量黏液和少量小颗粒干酪样物质,少数鸡可见肺部充血、出血。3.
实验室诊断3.1细菌分离培养

将鼻分泌物、鼻窦内的于酪样物质划线接种于普通营养琼脂培养基,再将金黄色葡萄球菌作井字划线接种于上述培养基,放置于蜡缸中37℃培养24
h后观察培养结果,可见在营养琼脂培养基上长出大量针尖大小透明菌落,菌落凸起、光滑、湿润、边缘整齐,且越靠近葡萄球菌菌苔的菌落越大,越远离葡萄球菌菌苔的菌落越小,再远离葡萄球菌菌苔几乎无细菌生长,符合副鸡嗜血杆菌培养的典型特征——“卫星现象”。将上述透明菌落收获于营养肉汤培养基中,命名为BS001细菌株,4℃保存备用。3.2细菌染色镜检
挑取上述针尖大小透明菌落涂布于载玻片上,酒精灯火焰固定后,按照细菌革兰氏染色标准步骤进行革兰氏染色,再将染色好的细菌涂片用显微镜油镜镜检,镜检结果为革兰氏阴性小杆菌,也有较长的杆菌。3.3细菌生化鉴定
将分离株进行生化鉴定,方法如下:①氧化酶试验:用接种环挑取上述细小菌落涂布于氧化酶试纸上,氧化酶试纸变红为阳性,不变色为阴性。②过氧化氢酶实验:将3%双氧水滴加到上述细小菌落上,有气泡产生为阳性,没有气泡产生为阴性。③其它生化试验:将上述4℃保存的营养肉汤细菌悬液,接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、硝酸盐还原、H:S试验、MR试验和VP试验共9种生化鉴定管,置5%CO:培养箱37℃培养48
h,观察细菌的生化特性,按照细菌生化微量鉴定管使用说明书判定生化结果。生化试验结果表明分离株BS001的氧化酶、过氧化氢酶阴性;发酵葡萄糖、半乳糖和蔗糖产酸不产气;发酵甘露糖产酸产气,不发酵乳糖、麦芽糖;H:S、MR试验、VP试验阴性。其生化鉴定结果与参考文献中的副鸡嗜血杆菌生化特征相符合,将分离株BS001生化鉴定为副鸡嗜血杆菌。澳门新浦京网投站网止,4.
诊断结果

结合该病的主要临床症状、主要病理变化以及细菌分离鉴定的结果,将该起病例确诊为鸡传染性鼻炎。5.
治疗措施

先用复方磺胺间甲氧嘧啶钠进行治疗,投药方式为饮水,用药剂量按说明书进行。具体方法如下:用100
g复方磺胺间甲氧嘧啶钠兑水100 kg,饮水给药,每天2次,连用5
d,病情得到有效控制。然后再用天津瑞普生物技术股份有限公司生产的鸡传染性鼻炎二价灭活疫苗进行全群鸡紧急免疫接种。本次治疗选用药物治疗加疫苗免疫注射的综合防制措施,取得了很好的治疗效果。6.
小结

鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起鸡的一种重要传染病,该病一年四季均可发生,但在气候寒冷潮湿、鸡群密度过大、通风不良条件下多发。该病主要发生于2月龄以上的青年鸡和产蛋鸡。该病在诊断过程中容易与禽流感、新城疫等其它呼吸道疾病相互混淆,应注意鉴别诊断。因此,病原分离鉴定就显得尤为重要。本研究对云南保山一起疑似蛋鸡传染性鼻炎的病例进行病理剖检和实验室细菌分离鉴定综合诊断,分离到一株副鸡嗜血杆菌BS001,这是云南省继李富祥等2012年首次报道副鸡嗜血杆菌分离后再次分离到副鸡嗜血杆菌,确诊该起病例为鸡传染性鼻炎,细菌分离鉴定仍然可作为鸡传染性鼻炎诊断的标准。该次临床诊断结合实验室诊断的综合诊断方法切实、可靠,值得推广应用。在该起病例的治疗过程中,首先采用鸡场消毒,再用复方磺胺间甲氧嘧啶钠治疗,病情得到很好的控制。在药物治疗方面,也有用中药治疗该病的成功案例。
笔者认为,中草药治疗鸡传染性鼻炎的方法也值得验证。由于该鸡场鸡群未进行过鸡传染性鼻炎疫苗免疫,笔者在药物治疗后再用鸡传染性鼻炎二价灭活疫苗进行全群鸡紧急免疫接种,取得了很好的治疗效果。由于该病的发生受气候条件、气温突变、鸡群饲养密度、通风条件等因素的影响,所以加强消毒、加强饲养管理和严格的防疫是防治本病的主要措施。

副猪嗜血杆菌(HPS) 是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD
依赖型、革兰氏阴性细小杆菌,属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。副猪嗜血杆菌只感染猪,有很强的宿主特异性,可以影响2
周龄到4
月龄的青年猪,主要在断奶后保育舍阶段发病,感染高峰通常见于保育期的4 ~ 6
周,发病率一般在10% ~
15%,严重时病死率可达50%。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的一种以急性败血症、多发性浆膜炎和关节炎为特征的细菌性传染病。该病为继发性疾病,常在蓝耳病病毒、圆环病毒等病毒感染后激发带菌猪和慢性感染猪发病,成为本病的传染源,病原菌主要存在于猪的上呼吸道,通过猪之间的接触、空气飞沫及污染物而传播。在集约化猪场中,
当猪群遭受环境不良、转群、去势、免疫注射、饲养不当等应激因素影响,
或者猪群感染猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性疾病时,
副猪嗜血杆菌病伺机暴发, 造成严重的经济损失 。目前,
该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。

1 发病情况及临床症状

在特定的条件下引起猪的多发性浆膜炎和关节炎,主要临床症状为发热、食欲不振、厌食、反应迟钝、咳嗽、呼吸困难、疼痛(
尖叫)、关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调,可视黏膜发绀、侧卧、消瘦和被毛凌乱随之可能死亡。种猪急性感染后可能留下后遗症,即母猪流产,公猪慢性跛行。特征性病理变化为胸腔、腹腔浆膜及肺部炎症,胸腔内有大量的淡红液体及纤维素性渗出物。肺表面覆盖有大量的纤维素性渗出物并与胸壁粘连,多数为间质性肺炎,部分有对称性肉变。各脏器有不同程度的出血、淤血和坏死。镜检渗出物中有大量纤维蛋白、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和单核细胞。实质细胞呈现不同程度的颗粒变性、水泡变性和坏死,实质和间质可见充血、出血、炎性细胞浸润、纤维性渗出和水肿液蓄积。

连城县莒溪镇罗某饲养500头猪(其中母猪40头、育肥猪120头、架子猪80头,其余为仔猪),2008年9月10日猪群突然发病,食欲减退或废绝,咳嗽,发烧,体温达41.5℃,个别猪呼吸困难、皮肤发红或苍白、眼睑水肿、跛行或不能站立,共济失调,特别是仔猪发病严重,且死亡3头。

近年来,副猪嗜血杆菌病在国内猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜,其发病率和死亡率日渐升高。为此,本实验对河南省内疑似病例进行病原分离培养,以对本病药物防控中药敏检测及其灭活菌苗研制奠定基础;本实验还采用病原学和生化鉴定诊断,
并进行药敏试验, 以期为该病的诊治提供临床依据。

2 病理变化

1 材料与方法

剖检病死猪,主要表现为腹膜炎、胸膜炎、心包炎、关节炎,可见化脓性及纤维蛋白渗出物,胸水、腹水增多、呈黄色,全身淋巴结肿大。

1.1 材料

3 实验室检查

1.1.1 病料采集

3.1涂片
无菌取患猪的心包液、肺、关节腔内容物涂片、革兰氏染色,镜检均见到革兰氏阴性的细小杆菌,以纤细杆状居多,美兰染色可见呈两极染色的长而弯细菌体。

对河南某猪场的15
头疑似副猪嗜血杆菌感染的病仔猪进行病理剖检。无菌条件下抽取心血、心包液和腹水,并采集病变明显的肺、心、肾脏等病料进行病原学检查。

3.2细菌分离培养
(1)无菌取患猪的心包液、肺、关节腔内容物,分别接种于血液平板培养基,37℃培养24~48
h,生长出小而透明的菌落,不溶血,挑取菌落涂片镜检,菌体形态与直接涂片一致;(2)将分离纯化的细菌与葡萄球菌共同接种培养,结果呈卫星现象;(3)将分离菌分别接种于普通巧克力琼脂斜面和经高压蒸汽(120℃30
min)加热的巧克力琼脂斜面,于37℃培养24
h,该菌仅会在高压巧克力琼脂斜面上生长良好。

1.1.2 菌种与主要培养基

3.3
生化试验细菌纯化培养后,分别接种系列生化培养基,结果该分离菌不分解乳糖、甘露醇,能分解葡萄糖、蔗糖、果糖,产酸不产气,氧化酶试验阴性,硝酸盐还原试验阳性。

金黄色葡萄球菌,各种药敏试纸片(左旋氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、乳酸环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾等);烟酰胺嘌呤二核苷酸、美兰染色、革兰氏染色、HE
染色试剂,普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、加NAD
的巧克力琼脂平板和TSA 培养基、TSB 液体培养基均自制。

3.4 药敏试验
取分离菌按常规纸片法进行药敏试验,结果该分离菌对阿莫西林、头孢类药、磺胺类药、四环素类等敏感。

1.1.3 生化鉴定微量发酵管及试剂

4 诊断

葡萄糖发酵管、蔗糖发酵管、甘露糖发酵管、木糖发酵管、棉籽糖发酵管、甘露醇发酵管、硫化氢微量发酵管,氧化酶、3%
过氧化氢、硝酸盐培养基。

根据临床症状、病理变化和实验室检查结果,确诊为副猪嗜血杆菌病。

1.2 方法

5 治疗

1.2.1 细菌的分离培养

1)全群猪每吨饲料添加70%阿莫西林300 g、30%黄芪多糖400 g,拌匀,连用7
d。

无菌操作条件下,
采集病猪的心血、心包液、腹水、肺、心、肾脏等病料,首先划线接种于含NAD
的巧克力琼脂平板或TSA 培养基上,37 ℃培养48
h,然后挑取单个菌落进一步纯化培养。

2)对发病猪用乾通动物药业生产的太古头孢(注射用头孢噻呋钠)每100 kg体重5
g,配高热冰峰(四季青注射液)每100 kg体重20 mL,肌注,每天1次,连用2 d。

1.2.2 染色镜检

3)用郑州福源动物药业有限公司生产的金维康每升水添加0.2 g混饮,连用3 d。

将培养后的单个疑似菌落涂片,进行美兰染色和革兰氏染色,
镜检,观察菌体形态及染色特性。

4)全场用成都市坤宏动物药业生产的聚维酮碘(每500 mL含25
mg聚维酮碘)按1:500稀释后进行彻底消毒。

1.2.3 培养特性

5)对个别患猪用超级头孢(氨苄西林钠)肌注,连用3 d。

取疑似副猪嗜血杆菌菌落分别接种于普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、含NAD
巧克力琼脂平板和TSA 培养基,37℃恒温培养48 h, 观察菌落的生长情况。

经以上方法治疗,疫情很快得到控制,5 d后全群猪恢复健康。

1.2.4 生化鉴定

6 小结

糖类分解试验:取纯培养后的细菌分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管内,倒置于洁净的小烧杯内,置灭菌培养皿中。37
℃培养24
h,观察并记录结果。结果判断:无变化,培养液仍为紫色,阴性反应;产酸,培养液为黄色及产酸又产气,培养液变黄,并有气泡,阳性反应。

1)根据该场发病情况、临床症状、病理变化和实验室检查结果诊断该病为副猪嗜血杆菌病,通过采取药敏试验选用敏感药物治疗和消毒等综合措施后,疫情很快得到控制。

硫化氢试验:取纯培养的细菌接种于硫化氢微量发酵管,置于37 ℃培养24 h
后观察,培养液黑色者为阳性,无色者为阴性。

2)疫苗的使用是预防该病的重要措施之一,建议使用灭活菌苗。

氧化酶试验:加2 ~ 3 滴试剂于滤纸上,用牙签挑取1个菌落到纸上涂布,
观察菌落反应。阳性反应在5 ~ 10 s 内由粉色到黑色,15 min
后可出现假阳性反应。也可以将试剂滴在细菌的菌落上,菌落成玫瑰红然后到深紫色者为阳性。

3)应加强猪场的饲养及日常消毒等管理工作。

触酶试验:可用接种环将菌落放于载玻片的中央,加1 滴3%
过氧化氢于菌落上,立即观察有无气泡出现;也可以直接将3%
过氧化氢滴加到菌落上观察有无气泡出现。

硝酸盐还原试验:把纯菌接种到硝酸盐培养基中,在37 ℃ 培养18 ~24
h,再加试剂甲(对氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L 醋酸100 mL)和乙(-奈胺0.5g
+5mol/L 醋酸100mL) 各3 ~ 5 滴,在30 s
内出现红色即为阳性。若无颜出现,加少量锌渣,随后出现红色则是真正的阴性试验。

1.2.5卫 星现象观察

挑取经纯化培养的可疑菌落,
于绵羊鲜血琼脂平板上水平画线,再挑取金黄色葡萄球菌垂直划线,37 ℃培养24
~ 48 h, 观察是否有卫星生长现象。

1.2.6 动物试验

将纯化菌接种于TSB 液体培养基,18 h
后经菌落计数,将培养液稀释成每毫升含2105 个菌,皮下注射0.2
mL稀释液于小白鼠。

1.2.7 药敏试验

将培养纯化的菌种均匀涂布于含NAD
的巧克力培养基上,然后按常规纸片法,将各种药敏试纸片(左旋氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、乳酸环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾等)贴于平板上,37
℃恒温培养18 ~ 24 h,观察抑菌圈大小。

判定标准: 抑菌圈直径大于15mm 为高度敏感;抑菌圈直径在10 ~ 15 mm
之间为中度敏感;抑菌圈直径小于10 mm 为耐药。

2 结果与分析

2.1 分离培养结果

分离到3 株细菌, 分别命名为HPS 1、HPS 2、HPS 3。

2.2 染色镜检

革兰氏染色阴性,多呈短杆状,
有的呈球杆状,出现急性败血症的病猪血涂片美兰染色可见大量细菌,符合副猪嗜血杆菌的菌落和细菌形态。

2.3 培养特性观察

3 株细菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基、鲜血培养基上均不生长, 在含NAD
巧克力培养基和TSA
培养基上呈光滑、无色透明或灰白色半透明、露珠状、扁平的小菌落。

2.4 生化鉴定结果

3 个菌株均发酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖,但不发酵甘露醇和木糖,
棉籽糖不稳定(HPS 1 为阳性,
其余为阴性),硫化氢试验呈阴性,氧化酶试验呈阴性,触酶试验呈阳性,硝酸盐试验呈阳性。所分离细菌鉴定结果均符合副猪嗜血杆菌的生化特性。

2.5 卫星现象观察

在金黄色葡萄球菌线两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长,呈现出典型的卫星现象并且不出现溶血现象,证明此菌为依赖NAD
生长的细菌。

2.6 动物试验结果

56 h后小白鼠出现毛松、呆滞等症状。68 h
后小白鼠出现死亡。从死亡的小白鼠回收到原病原菌。

2.7 药敏试验结果

从表1 可以看出,分离菌株对左旋氧氟沙星均高敏,
对恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、氟苯尼考、头孢噻呋钠全部敏感,对替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾均不敏感或耐药,对乳酸环丙沙星、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸等药物敏感性表现不一。

3 讨论

副猪嗜血杆菌曾被认为是一种随机入侵的次要病原,
在与猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、胸膜肺炎放线杆菌、链球菌等协同作用时才引发临床症状。目前在兽医临床上副猪嗜血杆菌病已经变成一种常见的、可独立发生的疾病。本试验在分离病原时,对发热期病猪采集耳缘静脉或前腔静脉的血液;
病猪死后,采集心血、心包液、胸水、腹水、纤维蛋白性渗出物、肺脏和肝脏等作为病料,在患猪剖杀或死亡后12
h 以内进行病原分离,可提高副猪嗜血杆菌的分离率。

细菌培养通过直接利用磷酸化NAD提供V
因子,解决了配制培养基的问题。所分离细菌菌落较大,呈圆形灰白而突起,为革兰氏染色阴性,短杆状或球杆状,细菌形态与报道的相一致,疑似菌株生化实验结果表明,不溶血,可发酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖,但不发酵甘露醇和木糖,硫化氢试验阴性,氧化酶试验阴性,触酶试验阳性,硝酸盐试验阳性,均符合副猪嗜血杆菌的培养特性。

从药敏试验结果可以看出,分离菌对氟喹诺酮类药物和头孢噻呋钠高度或中度敏感,有试验报道认为副猪嗜血杆菌对头孢唑啉高度敏感,对头孢哌酮、氟苯尼考敏感,而对复方新诺明、青霉素G
等有耐药性。原因可能是由于氟喹诺酮味苦而对猪群不常采用;左旋氧氟沙星和头孢噻呋钠的平均抑菌圈直径分别为22.0
mm 和13.3
mm,说明左旋氧氟沙星在被调查猪场应用较少,保持高度敏感,头孢噻呋钠已有应用,抗菌作用不理想;氨基糖苷类抗生素在临床上大量应用,通常以注射给药为主,所以呈现部分为中度敏感;普遍应用的青霉素、氨苄西林、阿莫西林和林可霉素等已不敏感。如果猪场经常使用某种抗生素,对母猪进行定期群体预防性混饲给药,其携带耐药基因的细菌会通过哺乳、与子代共同生活等而传递给下一代,使耐药性变得严重。也有学者进行中药药敏试验,结果表明金银花及其复方制剂对副猪嗜血杆菌抑制作用明显。因此在临床上,
应避免盲目用药现象,特别是在进行群体治疗时,最好先进行药敏试验,针对性地选择高敏药物,在发病早期采用全群注射给药法,或者采用部分中药制剂进行辅助治疗,以便达到最佳治疗效果。

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在寄生菌,是很难控制与净化的一种呼吸道感染病原。在环境卫生不好的猪场或者有其他发病感染时通常容易诱发副猪嗜血杆菌病的暴发。要想控制住疫情的暴发,猪场应该积极采取各种综合防控措施:首先应该改善饲养管理,补充饲料的各种营养成分,同时加强其他疾病的防控,自身也应该做好疫苗注射,增强仔猪对副猪嗜血杆菌的免疫力;其次,制订一套严格的管理制度,对外来的人员或外地购进的仔猪应该进行严格的检疫后才可进入养殖场;第三,对于养殖场自身环境进行改良,注意杀菌灭菌,防止猪的感染。

总之,副猪嗜血杆菌病的防治,应采取养防结合,有实力的养殖场应做药敏试验,选择敏感药物以便快速经济地控制副猪嗜血杆菌病的发生。预防中加强饲养管理,以减少或消除其他呼吸道病原,如提前断奶,减少猪群流动,杜绝猪生产各阶段的混养状况等。